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免疫印跡(WB)實驗步驟闡述
點擊次數(shù):852 更新時間:2023-11-28

WB,蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)又稱免疫印跡(immunoblotting),是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù),具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性,現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進行定性和半定量分析。

實驗步驟:

一、蛋白質(zhì)樣品制備

原始樣品可為細胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白,以下為定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法,其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻。

1.培養(yǎng)細胞或藥物處理。

2.棄培養(yǎng)基,用1X PBS漂洗細胞2次,去盡殘留培養(yǎng)基。

3.加入1X SDS樣品緩沖液,刮落細胞,轉(zhuǎn)移到Ep管。注意:冰上操作。

4.超聲10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。

5.煮沸樣品5min。

6.離心12000g,5min,取上清。

二、SDS-PAGE電泳

1、清洗玻璃板

2、灌膠與上樣

1). 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。

2). 配 10% 分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時,可用10ml槍吸取5ml 膠沿玻璃放出,待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水,液封后的膠凝的更快。

3). 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時,說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

4). 配 4% 的濃縮膠, 加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

5). 用水沖洗一下濃縮膠,將其放入電泳槽中。

6). 在電泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS電泳緩沖液,上樣。

7). 連接電泳槽到電泳儀。上槽接負極,下槽接正極,通電起始電壓70~ 80V,10min后100V,電泳2h或當(dāng)溴酚藍遷移至離底部1cm時,停止電泳。

三、轉(zhuǎn)膜

1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10min。 注意:若檢測小分子蛋白,可省略此步,因小分子蛋白容易擴散出膠。

2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6 片, 放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。 如用PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。

3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治:海綿3層濾紙膠膜,3層濾紙海綿,每層放好后,用試管趕去氣泡。切記:膠放于負極面(黑色面)。

4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中,放入三明治(黑色面對黑色面),加轉(zhuǎn)移緩沖液, 插上電極,100V,1h(電流約為 0.3A)。

5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,切斷電源,取出雜交膜。

四、封閉與雜交

1.用25ml TBS 洗膜5min,室溫,搖動。

2.置膜于25ml 封閉緩沖液中1h, 室溫,搖動。

3.15mlTBS/T洗3次(5min/T)。

4.加入合適稀釋度的一抗,室溫孵育1-2h或4°C過夜,緩慢搖動。

5.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。

6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗,室溫孵育1h,緩慢搖動。

7.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。

8.15ml TBS洗1次。

五、顯色

將 A、B 發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗,濾紙貼角吸干,反貼法覆于 A、B 混合液滴上,熄燈至可見淡綠色熒光條帶(5min 左右)后濾紙貼角吸干,置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中,迅速蓋上膠片,關(guān)閉膠盒,根據(jù)所見熒光強度曝光。取出膠片立即浸入顯影液中 1~2min,清水漂洗一下后放在定影液中至底片全定影,清水沖凈晾干,標(biāo)定Marker,進行分析與掃描。




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